Uma vez definido o local da biópsia, deve-se isolar a área para permitir a melhor visibilidade durante a coleta do material. Dessa forma, pode ser necessário usar presilhas, cortar ou até mesmo raspar os cabelos ao redor do local do exame. A área de isolamento necessária para a biópsia do couro cabeludo costuma ser bem pequena, de 1 a 2 centímetros.

A anestesia do local da biópsia é feita para que a coleta do material e os procedimentos posteriores sejam indolores. Esse é o único passo do exame em que há desconforto ou dor, que costumam ser toleráveis e de curta duração. Como o couro cabeludo é muito vascularizado, geralmente são usadas substâncias para diminuir o sangramento durante o procedimento.

Uma vez anestesiado, segue-se com a retirada do fragmento da pele para análise. Na grande maioria dos casos, essa retirada é feita com um punch, instrumental cirúrgico semelhante a uma caneta. Uma vez retirado, o material coletado pelo punch é encaminhado ao laboratório para preparação de lâminas e análise microscópica pelo médico patologista ou dermatopatologista.

Alguns casos específicos, no entanto, pode ser necessário retirar um fragmento maior com uma lâmina de bisturi.